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动物步态分析实验测试方法及注意事项

更新时间:2023-11-23       点击次数:581

VisuGait 动物步态分析系统是通过脚印光亮折射技术,采用高速摄像机采集移动中的大小鼠行走过程中的足印信息,然后利用我公司自主开发的足印步态分析系统自动识别分析小鼠的步态指标,以评价小鼠的运动和空间学习能力。评价指标包括:触地面积、摆动速度、摆动时长、制动时长、步行周期、前后肢步宽、正常步序比等等,以此客观评价PD模型的步态改变。

动物步态分析系统可用于评价神经创伤、神经性萎-缩、神经疾病、以及疼痛症状群的动物模型。该系统应用范围包括:脊索损伤、神经性疼痛、关节炎、中风、帕金森病、运动失调、脑损伤、外周神经损伤等疾病的研究。通过步态分析,了解神经源性疾病发展过程、评价治疗方法的效果和筛选治疗药物。

帕金森氏症导致肢体动作僵硬和协调性降低。步态分析系统通过测量动物模型中的脚间距离、摆动时相、支撑方式和正常步序比等参数评估运动协调性。

摘要

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是全-世-界-范围内第二大神经退行性疾病,由于目前并未开发出前期的诊断方法,在病程中后期已无法根-治,临床上多采用保守治疗,药物缓解症状和手术辅助治疗。目前常用左旋多巴来弥补多巴胺能神经元缺失所引起的多巴胺分泌不足,但是这种药物缓解PD症状依赖于多巴脱羧酶的催化而发挥药效,随着晚期PD病人的神经元缺失,这种酶也将减少,只能在早期发挥比较明显的作用,加大药量的同时也将产生更加明显的副作用,除了增加肝肾负担以外,还会引起不自主运动和精神错乱等症状,因此,继续探索PD的发病机制,寻找更加合适的药物靶标挽救神经元的缺失并探索合适的药物仍然是探索的方向。

研究背景

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种神经退行性疾病(Neurodegenerative disease),具有不断演变的复杂性。是以黑质-纹状体多巴胺能神经元的严重缺失以及路易小体和神经突触内含物的积累和扩散为主要病理标志的神经系统疾病。帕金森病被认为是继阿尔茨海默病之后第二大的神经退行性疾病,成为世界上患者增长速度最快的神经退行性疾病,自1990年到2015年的25年间,病患人数增长已一倍,达到600多万。随着全球老龄化愈加严重,预计到2040年,病患人数将再增长一倍。PD的发病机制和病因至今尚未明确, 并没有任何一种独立学说能够阐明其分子致病机制,已经证明的分子机制包括氧化应激下活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的过量产生、α-突触核蛋白(α-synuclein)沉积、多巴胺(DA)合成减少或线粒体功能障碍等。主要影响运动神经系统,临床症状主要包括:1.运动症状:静止性震颤、僵硬、步态异常等。2.睡眠障碍、认知障碍和抑郁等

为此,探究 PD 致病机制,阐明神经元缺失的分子机理或许是突破现有PD治疗策略的重要方向。

实验材料:

1.A53T转基因小鼠或基因敲除小鼠(品系均为C57BL/6J)。

2.10%酒精用于擦拭步态玻璃板。

注:75%酒精气味刺激性大,频繁使用将导致小鼠不愿通过跑道。

3.卫生纸。

4.空笼盒。

行为学测试步骤包括:

(1)VisuGait 动物步态分析系统软件,该软件从位于t台跑道下方的摄像机接收信息,并检测由于对跑道表面施加压力(例如,通过放置爪子)而从跑道表面反射的光线。

(2)把老鼠放到t台的一边。

(3)通过简单的按钮点击,以电子方式启动系统。

(4)让动物走到跑道的另一边。

模型建立与药物处理:

目前PD常用模型有神经毒素模型和基因编辑模型,其中神经毒素模型应用更加广泛。本课题两种模型均有涉及,对PD模型A53T转基因小鼠或基因敲除小鼠,使用小动物麻醉机对小鼠按推荐计量使用异氟烷进行麻醉后固定于脑立体定位仪上,通过颅骨钻在小鼠颅骨上钻孔,将显微注射针植入钻孔侧大脑纹状体区域后,使用 6-OHDA(8 mg/kg)对敲除小鼠纹状体注射,联同使用治疗药物21天。

动物生存环境:

将雌雄小鼠分开饲养每笼4-5只,分笼可避免发情和交配引起的激素水平改变,影响行为学的测试。室温控制在22-25℃,12-12小时光暗循环的安静环境中。给予充足的食物和饮用水。

Tip:实验动物生存环境一定要安静, 惊恐状态下的小鼠,行为异常,不能反映真实行为学指标。每组小鼠最好不少于8只,以减少个体间差异,避免实验偶然性。选择12-14周龄小鼠,神经退行性疾病小鼠随着年龄增加,神经元缺失更加严重,年龄太大,在病程后期,小鼠无法直立行走,年龄太小,表型不明显,观测不到运动异常指标。

提前适应环境:将小鼠提前两天放入测试环境空间饲养(最好是将设备放在饲养环境测试),更换环境后,小鼠因为空调出风口方向、光线照射位置、环境气味等改变,而表现出焦虑情绪,而PD患者本身就存在非运动症状,环境可能影响实验结果。

设备调试:步态利用的是脚印光亮折射技术,建议实验者提前一天在实验预计进行的同一时间段调试设备。


Tip:白天和夜晚的采光不同,通道的光线明暗对脚印识别至关重要,最初光调试设备就可能要花费几个小时。其次是相机参数设置,在多数神经退行性疾病模型中,需要分时间段进行行为学测试,进入步态软件设置标尺需要用A4纸画一个实体的标尺,在课题进行过程中,最好使用同一标尺,也不要改变软件中方框的大小,因为软件是通过等比例计算摆动距离、步长、前后肢间距等长度相关指数,只有在同一标尺下,不同时间段的指标才有比较的意义

测试前训练:步态分析的测试前训练是必要的,将实验鼠放入步态跑道上,第一次上跑道可将同笼鼠一起放入跑道5-10分钟,保持安静环境下,不进行测试,当老鼠通过通道,它会记住有一个出口可以回到笼子里和同伴待在一起,这将会是老鼠真正通过通道的动机。然后分别将实验小鼠放入跑道一端,将另一端用挡板封堵,在电脑前等待小鼠进入录像区域开始记录。


Tip:测试开始时,实验小鼠并不能很好适应环境,在惊恐状态下不会马上通过通道,切勿驱赶、恐吓方式促使小鼠通过跑道,一只老鼠几乎不会停留在玻璃板上超过20分钟不动,可能测试两三百只才回出现一次。在陌生环境中食物引诱的方法也不可取。在一个新的环境中,老鼠甚至不愿意尝试这种方法,因为这可能让他们觉得会威胁到健康。老鼠是全-球-最-成功的物种之一,它们非常聪明,通常会避免尝试任何新事物,除非是为了获益而承担风险。通过限制饲养粮食的量,每次通过通道后,通过奖励小食物颗粒来刺激动物穿过人行道,也有研究者这样操作。绝大多数(>95%)的小鼠在经过1-2周的训练后(动物被要求在每天12克的食物限制下每天跑2次),就能够迅速地连续跑过步态设备的玻璃板。这可能是小鼠天生的探索天性所使然。特别注意介绍步态相关文献中都强调了小鼠是在自愿状态下通过通道,记录真实的步态的。

在自然界中老鼠作为猎物,主要生活在地下,远离光线的环境中,老鼠是典型的胆小动物,任何外界施加的压力都有可能扰乱研究结果。强烈建议,在进行任何行为测试,实验者可以多花点时间接触自己的小鼠,以便它们熟悉人类接触。在随后的行为测试中,习惯于被研究人员拿起,突然被拿起来比安静待在笼子里的老鼠焦虑得多。当然,不建议实验者抓着老鼠的尾巴将它提起,这是老鼠最敏感的部位之一。在笼子里观察到实验小鼠的任何与焦虑相关的行为(打架、理发、过度梳理)也很重要,并在必要时采取措施进行干预。如果观察到打斗,可以将发起攻击的老鼠隔离并移出笼子。

不要俯视老鼠,不管你从哪个角度看着老鼠,它都会误以为是捕猎者,不要尝试推它或者恐吓它让它往前走,这会使它更不愿意行走。相反,如果你将它放在通道上,不被人注意到,在比较封闭的步态系统中它将会自由行走。

在一个新的环境中,老鼠甚至不愿意尝试这种方法,因为这可能会威胁到它们的健康。请记住,老鼠是全-球-最-成功的物种之一,它们非常聪明,他们通常会避免尝试任何新事物,除非他们能承担风险,并能从结果中获益。


 

 

在进行正式的行为学测试之前,研究者必须要熟悉设备和软件,VisuGait 动物步态分析系统使用起来非常直观和简便。只需要多进行几次测试,确保在正式测试时能够熟悉操作仪器和软件。

用挡板挡住通道回到小鼠笼的出口,将实验小鼠放置在通道入口,回到电脑前等待小鼠通过相机测试区域,不要尝试反复将小鼠放在同一位置开始,然后通过通道后又拿回起点,这样反复操作,小鼠会误以为自己的行为是错误的,导致它更长时间的停留。只需要将小鼠放置在入口,然后等待小鼠在玻璃板上来回行走时做好记录即可。记录数据时,在让软件上有“从右至左”和“从左至右”的选择,小鼠将在通道上来回行走,建议每只小鼠测5次以上,保证有清晰记录的图像记录。收集每只老鼠的多次连续的行走,并对这些行走进行平均分析,这可以减少实验误差。让每个实验老鼠多跑三次只需要多花几分钟,但是这对准确了解实验小鼠的总体步态有很大的帮助。

测试过程中,实验鼠随时会有大小便,使用10%酒精擦拭玻璃板,并迅速擦干,避免粪便污渍影响实验。老鼠是嗅觉十分敏感的动物,在行为学测试过程中,老鼠发现挡板和玻璃板上有其他不熟悉的味道,都会导致老鼠停止前进,分散注意力。

Tip:开始的前几只小鼠,需要立即进行步行分析,查看行为学测试结果有几十个指标被检测,通过传统的一次测试用一个表格导出数据不方便统计,通过与步态售后工程师沟通,开发了将一次实验所有检测指标汇总成同一表格内进行统计,大大简洁了统计过程。进图、压力图、步序图等参数是否可以正常记录。

测试时间尽量保证在同一时间段进行,白天光照强,到夜晚可能需要重新调整通道的两种LED灯亮度,重新检查各项参数是否正常,将增加不必要的时间成本。其次,老鼠的运动活跃程度可能与昼夜节律有关。

测试过程中尽量不要说话和产生噪音,特别是老鼠痛苦时发出的吱吱声,最好是在有舒缓的背景音乐状态下进行实验。正常情况下,老鼠受到惊吓和噪音都会导致实验小鼠本能停止,在奔跑过程中老鼠会因为其他声音暂时停止前进。

不同时间点检测同一项目实验鼠行为学参数,必须保证相机参数和标尺一致,才有可比性。

行为学测试结果有几十个指标被检测,通过传统的一次测试用一个表格导出数据不方便统计,通过与步态售后工程师沟通,开发了将一次实验所有检测指标汇总成同一表格内进行统计,大大简洁了统计过程。

摆动时长(Swing Duration摆动时长会随着速度的增加而减少,同时也有一个限度。关节炎动物可能会因为关节机动性的损失而使摆动时长增加。疼痛状态下摆动时长会增加,较长的前肢摆动持续时间可以提供给小鼠充分的机会让其在负载前进行臂肢放置。

摆动百分比(% Swing): 假设整个步幅时长(Stride Duration)是*,那么X%是脚爪接触( stance), Y%是非脚爪接触( swing)。X% stance+Y% swing=100% stride。典型的% swing大约为35%;此数值在加速状态下会明显增加。

步幅长度(Stride Length):同一脚爪的连续步幅之间的距离,正常状态下,给定动物的4个脚爪的此项数值几乎相等。胎儿期和初生期给予酒精会导致步幅长度显著地变短,当啮齿动物行走速度提高,步幅长度也会提高,触地时长会减少,有关节炎的小鼠同样会有较短的步幅长度。

触地宽度(Stance Width):一般地,前肢的触地宽度会小于后肢的触地宽度,此距离和身体尺寸有依赖性。更大或者更小的数值可能指示为稳定性而进行的姿势调整。人类会因为较少稳定而避免狭窄的脚步宽度。触地宽度有时候被称为“支撑基础”。

脚爪面积(Paw Area):脚爪面积可以指示足底放置范围作为神经损伤、体肢负载能力和疼痛程度的依据。例如,有慢性疼痛症的大鼠表现出有前后脚爪面积的改变。在Huntington舞蹈病的转基因模型上,后肢脚爪面积较小,但是在唐氏综合症模型上却无变化。

步幅时长(Stride Duration):小鼠在正常步行速度下的主导踏步模式是交替形式的,步幅时长取决于运动速度和步幅频率。所有体肢的步幅时长通常情况下是基本相等的。

 

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